內切酶是從細菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內切酶，目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的EcoR I識別：…GAATTC…切割后產生
…CTTAAG…
…G和AATTC…的末端
…CTTAA G…
該末端由于有一段小的能互補配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團。即…G-OH
…CTTAA-P。
有的限制性酶識別四堿基對的順序，如San3A識別GATC；有的識別六堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內切酶由于識別順序在DNA出現的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I
…GCGGCCGC…
…CGCCGGCG…。
則識別和切割位點更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現，因而切割后產生的片段變化范圍很大。
限制性內切酶作用的溫度一般為37℃，反應體系中以Mg2＋為單獨的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。
商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內*酶解1μg DNA的酶量）。
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